РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ

(19) RU (11) 2 728 601 (13) C1 (51) МПК G01N 33/48 (2006.01) C12N 5/078 (2010.01)

(54) Способ тестирования веществ, влияющих на процессы старения, по анализу крови

Изобретение «Способ тестирования веществ, влияющих на процессы старения, по анализу крови», относится к области медицины, биологии и может быть использовано в экологии, фармакологии и ветеринарии для тестирования веществ, влияющих на процесс старения в качестве оценки «антивозрастной» активности (АВА) различных веществ, лекарственных экстрактов и препаратов, пищевых продуктов, напитков и биологически активных добавок к пище (БАД).

Существующие методы оценки эффективности «антивозрастной» активности веществ и препаратов можно разделить на две группы:

- субъективные, заключающиеся в визуальной оценке состояния кожи, улучшении самочувствия пациента, повышении работоспособности;

- объективные - измерение глубины морщин, эластичности, увлажненности и жирности кожи после их применения наружно, изменение биохимических показателей крови, улучшение функционального состояния внутренних органов и систем после приема внутрь.

Недостатком существующих методов оценки эффективности «антивозрастной» активности веществ и препаратов является то, что об эффективности этих методов можно судить только после их использования.

Кроме того, существует высокий риск того, что препараты не окажут необходимого эффекта, в этом случае возникает вопрос об экономической целесообразности приобретения того или иного «эликсира молодости», поэтому предварительное тестирование препаратов и веществ на индивидуальную эффективность позволило бы исключить подобные риски.

Известен «Способ определения биологической активности веществ, содержащихся в жидких средах (в том числе наночастиц) см. RU №2426794, МПК C12Q 1/00, В82В 1/00, опубл. 20.08.2011, включающий помещение тестовых клеток в анализируемую жидкую среду, воздействие на них переменным напряжением, измерение средней амплитуды их колебаний при разных концентрациях среды и сравнение со средней амплитудой колебаний тестовых клеток в дистиллированной воде, дополнительно измеряют долю подвижных клеток и определяют их адаптацию и выживаемость совокупно по зависимости доли подвижных клеток и средней амплитуды их колебаний от концентрации веществ в анализируемой жидкой среде и от времени инкубирования в ней тестовых клеток, при этом для сравнения амплитуд используют показатель токсичности, вычисляемый по формуле:

где Т - показатель токсичности;

А_к - средняя амплитуда колебаний клеток в дистиллированной воде;

А_п - средняя амплитуда колебаний клеток в анализируемой пробе, далее по показателю токсичности определяют биологическую активность веществ; причем в анализируемую среду и дистиллированную воду добавляют вспомогательные вещества для обеспечения стабильной жизнедеятельности тестовых клеток, а в качестве тестовых клеток используют смесь разных видов клеток, кроме того, дополнительно измеряют силу тока, протекающего через анализируемую жидкую среду, и сравнивают с силой тока, протекающего через дистиллированную воду.

Недостатками этого способа помимо трудоемкости и необходимости использования чужеродных клеток является то, что по показателям адаптации и токсичности можно лишь отчасти оценивать безопасность назначаемых препаратов и веществ, но нельзя прогнозировать их эффективность.

Известен также «Способ определения суммарной антиоксидантной активности биологически активных веществ», см. RU №2356050, МПК G01N 33/15, G01N 27/26, опубл. 20.05.2009, включающий подготовку проб анализируемого и стандартного веществ, их электрохимическое окисление на стеклоуглеродном электроде и расчет показателя антиоксидантной активности, причем окисление анализируемого и стандартного вещества проводят в трехэлектродной электрохимической ячейке в аммиачных буферных растворах, а регистрацию вольтамперограмм осуществляют в классическом или дифференциальном режиме с последующим использованием значений высоты регистрируемых волн (пиков) для расчета антиоксидантной активности, при этом расчет показателя антиоксидантной активности (АОА) осуществляют по следующей формуле:

где I_x - высота пика (волны) анализируемого препарата, мм;

I_c - высота пика (волны) стандарта, мм;

V_x - объем анализируемого препарата, мл;

С_с - концентрация стандарта, г/л;

V_c - объем стандарта, мл;

V_ф - объем фонового раствора, мл;

V_p - разбавление анализируемого препарата, мл;

m - навеска анализируемого препарата, г.

Известный способ позволяет оценить антиоксидантную активность (АОА) различных лекарственных экстрактов и препаратов, пищевых продуктов, напитков и биологически активных добавок к пище (БАД). Способ также позволяет эффективно определять суммарную АОА биологически активных веществ с одновременным упрощением его реализации за счет использования серийного приборного оформления. АОА лекарственного препарата является одним из важнейших показателей его качества и мерой его биологической активности, однако, она характеризует восстановительные свойства препарата, но не его антивозрастную активность.

Наиболее близким к заявленному способу по функциональным возможностям является принятый за прототип «Способ тестирования веществ, влияющих на процесс старения» см. RU №2497950, МПК C12Q 1/68, , опубл. 20.04.2013, включающий в себя сборку нуклеосом из донорного хроматина с использованием очищенных препаратов гистонов Н2А, Н2В, Н3, Н4 натурального происхождения на ДНК-матрицах, где ДНК несет определенные мутации, ассоциированные с различными заболеваниями или со старением, активацию элонгации, внесение различных тестируемых агентов, способных стабилизировать или дестабилизировать компоненты матрицы, проведение транскрипции, оценку продуктов транскрипции. Для оценки продуктов или интермедиатов транскрипции возможно использование различных методов электрофоретического анализа, а также методы кристаллографии. Способность изменять активность транскрипции позволяет соответственно маркировать тестируемые вещества, как влияющие на процесс старения.

Недостатком известного способа являются низкие функциональные возможности и высокая трудоемкость.

Данные недостатки обусловлены тем, что известный способ включает в себя сборку нуклеосом из донорного хроматина с использованием очищенных препаратов гистонов Н2А, Н2В, Н3, Н4 натурального происхождения на ДНК-матрицах. Следует заметить, что ДНК, в любом случае, несет определенные мутации, которые ассоциируются с различными заболеваниями или со старением, активацией элонгации, внесением различных тестируемых агентов, способных стабилизировать или дестабилизировать компоненты матрицы.

Технической проблемой заявляемого изобретения «Способ тестирования веществ, влияющих на процессы старения, по анализу крови» является создание способа тестирования «антивозрастной» активности веществ и препаратов, направленных на лечение и профилактику различных патологий, в том числе связанных с возрастом.

Техническим результатом заявляемого изобретения «Способ тестирования веществ, влияющих на процессы старения, по анализу крови» является разработка безопасного для человека способа исследования взаимодействия веществ, препаратов и БАДов с тканями и клетками вне организма, определяющих антивозрастную активность по клеткам крови пациента.

Поставленный технический результат достигается тем, что в известном способе тестирования веществ, влияющих на процессы старения, по анализу крови, согласно изобретению, первоначально получали мононуклеарные клетки (МНК) пациента путем стандартного забора венозной крови с последующим выделением популяции мононуклеарных лейкоцитов (МНК), после чего оценивали способность выделенных клеток к активации, делению и гибели путем определения в культуре МНК пациента или условно здоровых доноров исходного соотношения клеток, находящихся в разных фазах клеточного цикла с помощью метода проточной цитометрии, далее подготавливали для тестирования исследуемое средство путем растворения и титрования для подбора доз, после чего проводили инкубацию культуры МНК пациента с рекомендованными дозами исследуемого средства с последующим определением в культуре МНК соотношения клеток, находящихся в разных фазах клеточного цикла, используя метод проточной цитометрии, после этого, проводили оценку полученных результатов, используя разницу распределения по фазам клеточного цикла.

Между отличительными признаками и достигнутым техническим результатом существует следующая причинно-следственная связь.

В отличие от аналогов и прототипа основным преимуществом предлагаемого способа тестирования веществ, влияющих на процессы старения, по анализу крови, является то, что заявляемый способ позволяет быстро (от забора материала до получения результата исследования не более 24 часов), высокотехнологично (определение клеточного цикла проводится методом проточной цитометрии с помощью проточного цитофлюориметра,) информативно (на 1-2 мл крови тестируется до 10 веществ, препаратов, БАДов), малоинвазивно (стандартный однократный забор венозной крови) и относительно недорого (проточные цитофлюориметры на сегодняшний день широко применяются в медико-биологических исследованиях) определять «антивозрастную» активность безопасно для человека путем взаимодействия исследуемых эффективных веществ, терапевтических препаратов и биологически активных добавок (БАД) с тканями и клетками вне организма in vitro и in vivo, путем стандартного забора венозной крови с последующим выделением популяции мононуклеарных лейкоцитов (МНК), и последующей оценкой способности выделенных клеток пациента, или условно здоровых доноров, к активации, делению и гибели, в отношении которых проверяется эффективность средства, влияющего на процессы старения, путем инкубации культуры МНК пациента или условно здоровых доноров с несколькими дозами исследуемого средства и с последующим определением в культуре МНК соотношения клеток, находящихся в разных фазах клеточного цикла, методом проточной цитометрии, используя разницу распределения по фазам клеточного цикла по шкале: негативный - интактный - положительный (слабый - умеренный - выраженный) результат. В заявленном изобретении использовали метод проточной цитометрии, являющийся одним из наиболее информативных комплексов, который позволяет измерять физические и биологические параметры отдельных клеток или частиц и основан на регистрации светорассеяния и флуоресценции от отдельных клеток или частиц, проходящих через лазерный луч в потоке жидкости. Метод проточной цитометрии применяется в том числе и при исследовании периферической крови человека, в частности лейкоцитов. Анализ соотношения фаз клеточного цикла позволяет оценить способность клеток к активации, делению и гибели, с его помощью исследуются различные фазы клеточного цикла.

Проведенный заявителем анализ уровня техники, включающий поиск по патентным и научно-техническим источникам информации и выявление источников, содержащих сведения об аналогах заявленного изобретения, позволил установить, что заявитель не обнаружил источник, характеризующийся признаками, тождественными совокупности всех существенных признаков заявленного изобретения «Способ тестирования веществ, влияющих на процессы старения, по анализу крови», т.е. по имеющимся у заявителя сведениям, совокупность существенных признаков заявляемого изобретения, обеспечивающая решение технической проблемы и достижение технического результата в виде разработки безопасного для человека способа исследования взаимодействия веществ, препаратов и БАДов с тканями и клетками вне организма, определяющих антивозрастную активность по клеткам крови пациента, не известна из уровня техники, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию “новизна”.

Для проверки соответствия заявленного изобретения критерию "изобретательский уровень" заявитель провел дополнительный поиск известных решений, чтобы выявить признаки, совпадающие с отличительными от прототипа признаками заявленного изобретения «Способ тестирования веществ, влияющих на процессы старения, по анализу крови». Результаты поиска показали, что заявленное изобретение «Способ тестирования веществ, влияющих на процессы старения, по анализу крови» не вытекают для специалиста явным образом из известного уровня техники, поскольку из уровня техники, определенного заявителем, не выявлено влияние предусматриваемых существенными признаками заявленного изобретения преобразований для достижения технического результата, а именно отсутствие разработки безопасного для человека способа взаимодействия исследуемых эффективных веществ и препаратов с тканями и клетками вне организма, определяющих антивозрастную активность. Следовательно, заявленное изобретение «Способ тестирования веществ, влияющих на процессы старения, по анализу крови» соответствует критерию "изобретательский уровень".

Таким образом, изложенные сведения свидетельствуют о выполнении при использовании заявленного изобретения «Способ тестирования веществ, влияющих на процессы старения, по анализу крови» технических средств, в описанном в заявке примере конкретного выполнения, т.е. подтверждена возможность его осуществления с получением технического результата, а именно разработки безопасного для человека способа исследования взаимодействия веществ, препаратов и БАДов с тканями и клетками вне организма, определяющих антивозрастную активность по клеткам крови пациента. Технические средства и используемый метод проточной цитометрии, являющийся одним из наиболее информативных комплексов, позволяющий измерять физические и химические параметры отдельных клеток или частиц, основанный на регистрации светорассеяния и флуоресценции отдельных клеток или частиц, проходящих через лазерный луч в потоке жидкости способствуют достижению технического результата. Метод проточной цитометрии применяется в том числе и при исследовании периферической крови человека, в частности лейкоцитов. Анализ соотношения фаз клеточного цикла позволяет оценить способность клеток к активации, делению и гибели, воплощающие заявляемое изобретение «Способ тестирования веществ, влияющих на процессы старения, по анализу крови» способны обеспечить достижение усматриваемого заявителем технического результата, т.е. создать универсальный, безопасный для пациента, легко воспроизводимый способ, позволяющий прогнозировать индивидуальную эффективность препаратов, влияющих на процесс старения по анализу крови пациента, что, в конечном итоге, ведет к определению антивозрастной активности при реализации заявленного способа, следовательно, заявленное изобретение, соответствует условию "промышленная применимость".

Сущность заявляемого изобретения «Способ тестирования веществ, влияющих на процессы старения, по анализу крови» поясняется описанием примеров реализации способа.

Для осуществления заявленного способа тестирования веществ, влияющих на процессы старения, мононуклеарные клетки (МНК) пациента или условно здоровых доноров получали путем стандартного забора венозной крови с последующим выделением популяции мононуклеарных лейкоцитов (МНК), после чего оценивали способность выделенных клеток к активации, делению и гибели путем определения в культуре МНК пациента или условно здоровых доноров исходного соотношения клеток, находящихся в разных фазах клеточного цикла методом проточной цитометрии. Затем подготавливали для тестирования исследуемое средство путем растворения и титрования для подбора доз. Вслед за этим проводили инкубацию культуры МНК пациента с несколькими (рекомендованными) дозами исследуемого средства с последующим определением в культуре МНК соотношения клеток, находящихся в разных фазах клеточного цикла, методом проточной цитометрии, далее, используя разницу распределения по фазам клеточного цикла, проводили оценку полученных результатов.

«Способ тестирования веществ, влияющих на процессы старения, по анализу крови» также отражен заявителем в следующих трех примерах конкретного выполнения:

I. Индивидуальный прогноз эффективности веществ, препаратов, БАДов, влияющих на процесс старения «in vitro», в котором первоначально проводили выделение пула мононуклеарных клеток (МНК) из венозной крови индивидуума, в отношении которого проверяли эффективность средства, влияющего на процессы старения. Далее проводили подготовку для тестирования исследуемого средства (препарата, вещества, биологически активной добавки и пр.) - растворение (при необходимости), «отмывание» (при необходимости), титрование для подбора дозы, после чего методом проточной цитометрии определяли в культуре МНК индивидуума исходное соотношение клеток, находящихся в разных фазах клеточного цикла. Далее проводили инкубацию культуры МНК индивидуума с несколькими, предварительно подобранными дозами исследуемого средства (препарата, вещества, биологически активной добавки и пр.) с последующим определением в культуре МНК соотношения клеток, находящихся в разных фазах клеточного цикла, методом проточной цитометрии. После этого проводили оценку полученных результатов по разнице распределения клеток по фазам клеточного цикла по шкале: негативный - интактный - положительный (слабый - умеренный - выраженный) результат.

II. Индивидуальный прогноз эффективности веществ, препаратов, БАДов, влияющих на процесс старения «in vivo», в котором первоначально проводили выделение пула мононуклеарных клеток (МНК) из венозной крови индивидуума, в отношении которого проверяли эффективность средства, влияющего на процессы старения, с целью определения исходного распределения клеток по фазам клеточного цикла методом проточной цитометрии. Далее проводили прием индивидуумом тестируемого средства (препарата, вещества, биологически активной добавки и пр.) в рекомендованной производителем форме и дозировке, после чего проводили повторный забор венозной крови у пациента по истечении некоторого времени (от 20 минут до 72 часов и более). После этого проводили повторное определение в культуре МНК индивидуума соотношение клеток, находящихся в разных фазах клеточного цикла, методом проточной цитометрии. Далее оценивали полученные результаты по разнице распределения клеток по фазам клеточного цикла по шкале: негативный - интактный - положительный (слабый - умеренный - выраженный) результат.

III. Тестирования исследуемого средства (препарата, вещества, биологически активной добавки и пр.) на наличие «антивозрастной» активности (АВА), в котором первоначально проводили выделение пула мононуклеарных клеток (МНК) из венозной крови условно здоровых доноров. Следом осуществляли подготовку для тестирования исследуемого средства (препарата, вещества, биологически активной добавки и пр.) - растворение (при необходимости), «отмывание» (при необходимости), титрование для подбора дозы. Далее определяли в полученной культуре МНК исходное соотношение клеток, находящихся в разных фазах клеточного цикла, методом проточной цитометрии. Затем проводили инкубацию культуры МНК с несколькими дозами исследуемого средства (препарата, вещества, биологически активной добавки и пр.) с последующим определением в культуре МНК соотношения клеток, находящихся в разных фазах клеточного цикла, методом проточной цитометрии. После чего проводили оценку полученных результатов по разнице распределения по фазам клеточного цикла по шкале: негативный - интактный - положительный (слабый - умеренный - выраженный) результат.

lV. У группы условно здоровых доноров забирали кровь из локтевой вены в вакуумные пробирки с добавлением антикоагулянта К₃ЭДТА.

Выделение мононуклеарных клеток лейкоцитов из забранной крови проводили стандартным методом центрифугирования в градиенте плотности фиколл-урогрофин («Pharmacia», Швеция) (р=1,077 г/см³). Мононуклеары (МНК) однократно отмывали путем избытка физиологического раствора при 300g 10 минут. На первом этапе определяли исходное соотношение фаз клеточного цикла в культуре МНК с помощью тест системы CycleTEST™PLUS (BECTON DICKINSON, США) по иснструкции производителя. Анализ проводили на проточном цитофлуориметре CytoFLEX (Beckman Coulter, США). На втором этапе в лунки 96-луночного плоскодонного планшета вносили 200 мкл. клеточной суспензии (2×10^6\) в полной культуральной среде и добавляли исследуемый препарат (Экстракт пептидный из плаценты лиофилизированный производства ООО НПК «Тринити М» г.Новосибирск. ТУ 9158 - 003-03533859-2010) приготовленный по инструкции производителя, в дозе 200 мкл на лунку. Инкубацию клеток осуществляли в присутствии исследуемого вещества. Время инкубации составило 3 часа при t 37°C в атмосфере 5% СО₂. После инкубации клеточную суспензию отмывали однократно путем избытка физиологического раствора при 300g 10 минут, определяли исходное соотношение фаз клеточного цикла в культуре МНК с помощью тест системы CycleTEST™PLUS (BECTON DICKINSON, США) по инструкции производителя. Анализ проводили на проточном цитофлуориметре CytoFLEX (Beckman Coulter, США).

После этого, используя разницу распределения клеток по фазам клеточного цикла, проводили оценку полученных результатов.

Таблица 1.

Распределение клеток в культуре МНК по фазам

клеточного цикла (%).

	Апоптоз <2N	Покой G0+G1	Синтез >2N<4N	Пролиферация G2+M4N
Исходное	1,91 + 0,1	96,6 + 8,2	1,36 + 0,09	0,07 + 0,006
После инкубации с тестируемым препаратом	10,63 + 1,05***	85,2 + 0,1***	3,13 + 0,27***	0,88 + 0,07***

Примечание. *** - достоверность различий между исходным процентом клеток, находящихся в данной фазе и после инкубации с тестируемым веществом (p<0,001).

Вывод: Исследуемый препарат обладает высокой активационной способностью.

Используемый в заявленном изобретении метод проточной цитометрии, является одним из наиболее информативных комплексов, который позволяет измерять физические и биологические параметры отдельных клеток или частиц и основан на регистрации светорассеяния и флуоресценции от отдельных клеток или частиц, проходящих через лазерный луч в потоке жидкости. Используемый в заявленном изобретении метод проточной цитометрии применяется в том числе и при исследовании периферической крови человека, в частности лейкоцитов. Анализ соотношения фаз клеточного цикла позволяет оценить способность клеток к активации и делению, с его помощью исследуются фазы клеточного цикла, а именно: оценивается распределение клеток по G1/G0-, <2N, >2N<4N и G2+M4N фазам клеточного цикла путем определения относительного содержания ДНК в клетках при помощи ДНК-связывающих флуоресцентных красителей, таких как PI (йодистый пропидий), 7-AAD (7-аминоактиномицин), DAPI (4'6'-diamidino-2-phenylindole (DAPI)), Hoechst, SybrGreen.

Таким образом, заявленное изобретение «Способ тестирования веществ, влияющих на процессы старения, по анализу крови» позволит разработать высокотехнологичный, информативный и безопасный для человека способ исследования взаимодействия веществ, препаратов и БАДов с тканями и клетками in vitro и in vivo, определяющих антивозрастную активность по разнице соотношения фаз клеточного цикла клеток крови пациента. Кроме того, предложенное изобретение «Способ тестирования веществ, влияющих на процессы старения, по анализу крови» обеспечивает разработку, т.е. дает возможность проводить тестирование «антивозрастной» активности веществ, препаратов и БАДов, направленных на лечение различных патологий, в том числе связанных с возрастом.

Формула изобретения

Способ тестирования веществ, влияющих на процессы старения, по анализу крови, отличающийся тем, что первоначально получали мононуклеарные клетки (МНК) пациента путем стандартного забора венозной крови с последующим выделением популяции мононуклеарных лейкоцитов МНК, после чего оценивали способность выделенных клеток к активации, делению и гибели путем определения в культуре МНК пациента или условно здоровых доноров исходного соотношения клеток, находящихся в разных фазах клеточного цикла с помощью метода проточной цитометрии, далее подготавливали для тестирования исследуемое средство путем растворения и титрования для подбора доз, после чего проводили инкубацию культуры МНК пациента с рекомендованными дозами исследуемого средства с последующим определением в культуре МНК соотношения клеток, находящихся в разных фазах клеточного цикла, используя метод проточной цитометрии, после этого проводили оценку полученных результатов, используя разницу распределения по фазам клеточного цикла.